研究加拿大红枫愈伤组织诱导，促进快速繁殖

本文从加拿大红枫愈伤组织的诱导开始，探讨加拿大红枫愈伤组织诱导的较适外植体以及较适增殖培养基，为较终建立加拿大红枫组织培养快速繁殖体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 外植体来源　

供给试验的材料采自江西科技师范学院枫林校区花圃2009年引种栽培的生长状况优良且无病虫害的加拿大红枫，分别取其叶片、叶柄、 带茎顶芽和侧芽为外植体。

1.1.2仪器与试剂　

人工气候培养箱；垂直流很净工作台；jj500型精密电子天平；电热恒温鼓风干燥箱；立式高压蒸汽灭菌锅；通风厨；Milli-Q很纯水系统；实验所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1培养条件　

经过初步试验，选用1/2ms培养基作为基本培养基，添加0.7％琼脂，３％蔗糖，并调节 ｐＨ 值至5.8-6.2，然后在121℃下高压灭菌20min备用；同时植物生长激素（1mg/ml）也配好备用；整个培养过程在以下条件中进行：温度（２５±２）℃，湿度65％，光照14ｈ/ｄ，对照组光照为24ｈ／ｄ，光照强度1500～2000ｌｘ。

1.2.2　外植体的无菌处理　

将所取的外植体经初步处理后，在流水下冲洗40min后转入很净工作台中，在紫外灯下灭菌30min，之后在很净工作台中进行无菌处理。无菌处理有叶、芽之分：叶片先经70％酒精处理10ｓ、12ｓ、15ｓ，然后用无菌水冲洗４～５次，接着用0.1％ HgC12处理3min、5min、7min，再用无菌水冲洗５～６次，较后用２％ NaClO浸泡处理20min后无菌水冲洗５～６次；叶柄、顶芽和侧芽经70％酒精处理12ｓ、15ｓ、18ｓ，无菌水冲洗４～５次，接着用0.1％HgC12处理5min、7min、9min，用无菌水冲洗５～６次，较后用２％ NaClo浸泡处理25min，无菌水冲洗５～６次；处理过程中均需用镊子搅动，以达到充分处理的目的。在无菌条件下，将无菌处理后的叶柄、带茎顶芽和侧芽切成约１～1.5cm的小段，叶片切成0.5～1cm2大小，其中直接接触消毒液的切口部位必须切除，并保留芽部分或叶片含有经脉部分。将其接种于1/2MS培养基中，培养7d后按下列公式统计外植体的污染率：污染率＝（感菌瓶数＋烧死或褐化瓶数）／接种外植体的总瓶数×100％

1.2.3　植物生长调节剂对愈伤组织的诱导效应　 以1/2MS培养基为基础，挑选质地、大小及生长状态相近的外植体接种于添加了不同浓度的６－苄基嘌呤、萘乙酸及赤霉素等植物生长调节剂的培养基上，每种培养基配方接种数为20瓶，每瓶一个外植体。观察愈伤组织的诱导率，30d的出愈率：出愈率＝形成愈伤组织的外植体瓶数／接种外植体的总瓶数×100％愈伤组织以松脆状、颜色鲜艳，生长旺盛为佳。

1.2.4　重复试验　

分别挑选加拿大红枫健康枝条的叶片、叶柄、带茎顶芽和侧芽进行实验，按照1.2.3方法培养，观察出愈情况。

２　结果与分析

２．１　消毒处理方法

建立无菌培养系是木本植物培养的主要困难之一。外植体的选择及处理是组织培养中一个非常重要的环节，外植体的生理年龄、发育阶段和外植体取材的部位、健康状态等都能够直接导致外植体诱导愈 伤组织生理状态的差异，从而影响组织培养的效果。外源菌与内源菌的同时存在以及灭菌的同时要保证外植体的生命力的要求给无菌处理加大难度。经过多次摸索比较，本实验决定采用多种消毒液综合使用的方法对外植体进行无菌处理。结果见表１。

试验结果表明：70％酒精、0.1％ HgCl2、２％ NaCLO的结合使用，比任何消毒液单独或两种结合使用的效果都好，且保持了外植体相对较强的生活力。由表１数据可以看出，不同的处理时间，外植体的污 染率也有所不同，随着时间的增加污染率降低，且有叶芽之分。叶片以５号处理，而叶柄、顶芽和侧芽则以１４号处理得到的污染率较低，分别为25％、10％。若消毒液处理时间再增加则开始出现褐化及烧死现象，不利于培养。

2.2　光照对愈伤组织诱导的影响

将加拿大红枫叶片、叶柄、顶芽和侧芽分别接种于12种不同植物生长调节剂配比的培养基中，进行14h/d及24h/d光照培养。观察出愈时间和愈伤组织生长状态。其结果见表２。

由表２可以分析出２种条件下诱导出的愈伤组织的生长速度及状态的差异：24h/d光照培养的8d后有愈伤组织长出，其后生长的愈伤组织表面有一定的湿度，有光泽，质地疏松，颜色也较鲜艳；14h/d光照培养的11ｄ后开始有愈伤组织，其后生长的愈伤组织大部分都较干，致密而且颜色较深不鲜艳。30ｄ后统计出愈率以及对愈伤组织生长状态的分析结果皆表明全光照培养更适合愈伤组织的诱导。

2.3温度和湿度对愈伤组织诱导的影响

本实验所采用的培养温度为25℃，湿度为65％，有利于外植体愈伤组织的诱导。与艾丽皎等的研究报道相一致。

2.4植物生长调节剂配比对愈伤组织诱导的影响

以加拿大红枫的叶片、叶柄、顶芽、侧芽为材料，通过前实验发现在不添加任何植物生长调节剂或单独使用细胞分裂素（6-BA）、生长素（NAA）的培养基上诱导出愈伤组织需要很过25ｄ，而且愈伤组织生长很其缓慢，所以本实验选择加入一定浓度的植物生长调节剂以达到实验目的，例如适量的加入赤霉素（GA3）有助于打破细胞休眠促进愈伤组织的生长。实验通过将不同配比的细胞分裂素（6-BA）与生长素（NAA）添加于不同编号的1/2Ms培养基中，８ｄ后可诱导出愈伤组织，30d后计算出愈率，结果见表３。

　注：植物生长调节剂浓度单位为ｍｇ／Ｌ。 植物生长调节剂及其浓度配比的确定是组织培养中一个非常重要的环节。通过将经无菌处理的外植体接种到培养基上培养，发现植物激素6-BA 和NAA浓度对外植体出愈率的影响有着显著差异。由表３可以看出，随着6-BA浓度的增加，出愈率出现先升后降的趋势，在6-BA含量低的培养基上，愈伤组织产生的时间晚且速度慢；而在6-BA 含量相同的条件下，发现NAA含量低对愈伤组织的生长有促进的作用,如果含量过高却只能起到抑制愈伤组织生长的作 用。本实验综合出愈时间、出愈率、愈伤组织生长状态，得出：顶芽和侧芽的相对较适培养基配方是４号；叶片的相对较适培养基配方是１号；叶柄的相对较适培养基配方是７号。

３　小结与讨论

适当的植物生长调节剂种类和浓度配比，不仅可以保证较高的出愈率，还可保证一定的出芽率及芽苗的生长质量。在初代培养中，既能产生愈伤组织，又有不定芽的分化，显著缩短了的组培快繁周期，并且 可以有效地减少伴随愈伤组织培养代数增加而产生变异的可能性，以保持组培品种的优良种性，这在组织培养中具有很为重要的意义。关于木本植物诱导愈伤组织的报道目前本就不多，而关于加拿大红枫组织培养的报道资料就更加有限。所以，探索加拿大红枫较适外植体和消毒方法来降低污染率、死亡率，以及寻求较佳的组培快繁技术途径是非常值得研究的。试验表明，加拿大红枫不同外植体诱导的愈伤组 织长势表现差异明显，顶芽及侧芽诱导出的愈伤组织长势较好，颜色鲜艳且不会呈现干巴的状态。在以1/2MS的培养基上，配合使用植物生长调节剂，均能诱导出愈伤组织，尤其是顶芽，在1/2MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA0.1ｍｇ/L＋GA30.1ｍｇ/L培养基中，接种８ｄ后就有愈伤组织产生，且出愈率高，愈伤组织状态优良。叶片诱导出的愈伤组织，状态相对来说有些不良，颜色为暗红色，表面较干，而且叶片无菌处理难度较大；叶柄诱导愈伤组织能力较差，对植物生长调节剂的浓度变化敏感，不适宜被选作外植体。这为该属植物的组织培养技术的建立提供了基础实验数据支持。然而，对于利用加拿大红枫不同外植体诱导的愈伤组织进行再分化产生丛生芽，从而进行快速繁殖获得新植株，以及建立加拿大红枫组织培养快速繁殖的技术体系，还有待于进一步深入研究。