作者：彩枫美国红枫基地 发布时间：2012年8月4日
美国红枫是槭树属植物,近几年来， 槭树属植物的繁殖技术特别是快繁技术逐渐受到重视, 目前国内外对槭树科植物的组培快繁技术研究较少, 仅有茶条槭、元宝槭和挪威枫等少数几种建立了较为完善的组织培养体系。作为槭树属植物中较流行的彩色绿化植物之一的美国红枫, 其繁殖技术的研究还多停留在播种、扦插等传统育苗方式上, 而有关组培快繁方面的研究报道较为少见。现通过美国红枫组织培养过程中外植体选择及灭菌、启动培养和褐化抑制等技术的探讨研究, 为以后美国红枫组织培养技术的进一步研究提供了依据。
1 材料与方法
1. 1 材料试验材料取自生长健壮的美国红枫母株, 由北京林业大学良种繁育研究中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 外植体的消毒
分别取木质化茎段、半木质化茎段、室内水培芽、当年实生苗作为外植体,选用70% 乙醇、0. 1% 升汞、1% 次氯酸钠3 种消毒剂。将试验材料剪切成1. 5~ 2. 0 cm 带腋芽茎段( 尖) , 用毛刷蘸肥皂水刷洗3~ 5 min, 流水冲洗30 min, 转移至很净工作台。在无菌条件下,用70% 的乙醇消毒30 s, 再分别用不同的消毒剂处理, 较后用无菌水冲洗3~ 5 次, 切去伤口部分,接种到启动培养基上。每个处理接种30 个外植体, 重复3 次, 15 d 后统计外植体污染率、褐化死亡率、存活率及观察生长状况, 并按公式计算相关参数:
污染率/% = 污染个数/ 接种个数@ 100
褐化死亡率/%= 褐化死亡个数/ 接种个数@ 100
存活率/% = ( 接种个数- 污染个数- 褐化死亡个数) / 接种个数@ 100
1. 2. 2 褐化抑制
将经过消毒处理的外植体按5 种处理方式进行分析外植体的褐化现象, 每个处理接种30 个外植体, 重复3 次, 10 d 后比较各处理方式对褐化的抑制效果, 并按以下公式计算相关参数:
褐化率/% = 褐化个数/ 接种个数@ 100
处理方式:
Ñ. 对照( CK) ;
Ò. 添加活性炭( AC) 1 g#L-1 ;
Ó. 添加硝酸银( AgN O3 ) 10 mg#L-1 ;
Ô. 添加聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 1 g#L-1 ;
Õ. 接种初期每两天将外植体转移至新鲜培养基中, 重复2~ 3 次。
1. 2. 3 外植体的启动培养
将经过消毒处理的外植体接种含有不同浓度6-BA、NAA 的MS 培养基中培养, 每个处理接种30 个外植体, 重复3次, 30 d 后观测茎段抽芽数量, 并按公式计算相关参数:
抽芽率/% = 抽出新芽并达到21 0 cm 以上的外植体个数/ 接种个数@ 100
2 结果与分析
2. 1 外植体的选择
2. 1. 1 外植体种类对其成活率的影响
将4 种外植体均用1%次氯酸钠消毒5 min, 从表1 中数据可以看出, 以当年实生苗为外植体进行培养时, 其污染率和褐化率较低, 分别为7. 78% 和5. 55%, 成活率较高为86. 67% , 其次是室内水培芽和半木质化茎段, 效果较差的是木质化茎段。
2. 1. 2 外植体种类对腋芽生长的影响
取未污染的外植体各25 个继续培养, 30 d 后统计抽芽个数计算抽芽率, 并观察抽芽时间以及芽苗的生长情况。由表2 可以看出, 不同外植体其腋芽抽芽时间和抽芽率有较大差别, 半木质化茎段和木质化茎段所需的抽芽时间较短, 为5~ 7 d, 抽芽率分别为84. 00% 和80. 00% ; 室内水培芽抽芽需要的时间为10~ 15 d, 抽芽率为72. 00% , 而当年实生苗抽芽需要15 d 以上, 抽芽率为28. 00% 。从腋芽的生长情况来看, 木质化茎段、半木质化茎段以及室内水培芽的新生腋芽都生长健壮; 而当年实生苗腋芽生长细弱。综合各因素考虑, 选择半木质化茎段作为美国红枫组织培养的外植体较为合适。
2. 2 外植体表面灭菌
选择不同的消毒剂( 70% 乙醇、0. 1% 升汞、1%次氯酸钠) 和不同处理时间( 2、4、8、15 min) 对半木质化茎段进行表面消毒, 从表3 中结果可以看出, 随着消毒时间的增加, 外植体的污染率总体趋势都在逐渐下降, 而褐化率却随着消毒时间的增加而上升, 从单因素角度来看, 75%乙醇的消毒效果较差, 0. 1%升汞虽然消毒效果较好但是褐化严重, 导致较终成活率较低, 1% 次氯酸钠的作用界于二者之间, 在消毒4 min 时成活率较高为82. 22%消毒处理不仅影响外植体的表面消毒效果,而且对随后外植体的腋芽生长也有较大影响。从表3 中可以看出, 3 种消毒剂的作用都是随着消毒时间的增加而抽芽率下降, 经过长时间75% 乙醇消毒后新芽长势细弱, 叶片颜色黄绿; 经过短时间的0. 1% 升汞消毒后新芽能够正常生长, 但长时间的消毒处理会导致腋芽不易抽芽, 且抽出的新芽生长畸形; 而用1% 次氯酸钠消毒处理后抽出的新芽叶片颜色深绿, 长势健壮。因此, 从提高外植体的成活率同时又尽量降低消毒剂对外植体伤害的角度考虑, 采用1% 次氯酸钠溶液消毒4 min 为较佳消毒方式。
2. 3 褐化
在对美国红枫茎段培养时发现, 外植体普遍存在褐化现象。为此, 选用5 种不同的处理方式对美国红枫外植体褐化现象的抑制作用进行比较研究, 结果表( 见表4) , 处理Õ的褐化率为0, 褐斑直径为0, 能有效的抑制外植体褐化。
表4 不同处理方式对控制外植体褐化的影响
处理 褐化率% 平均褐斑直径/cm
Ⅰ 44.44 1.73
Ⅱ 15.56 -
Ⅲ 21．11 0.82
Ⅳ 17.78 0.65
Ⅴ 0 0
2. 4 启动培养基的筛选
将经过消毒处理的外植体接种到培养基上培养, 发现植物激素6-BA 和NAA 浓度对外植体抽芽率的影响有着显著的区别, 随着6-BA 和NAA浓度的增加, 腋芽的抽芽率都表现出先升高后降低的趋势, 在6-BA含量低的培养基上生长的腋芽抽枝较慢, 生长也较慢, 节间不展开, 随着浓度的增加愈伤组织生长旺盛, 外植体渐渐枯死,在6-BA含量相同的条件下NAA 在很低含量的时候就能促进腋芽的抽芽和生长, 而过高的浓度反而会导致愈伤组织的大量生长。数据经过反正弦转换后进行2 因素4 水平的方差分析( 见表6,表7, 表8) , 结果表明, 6-BA 和NAA 各水平间的差异以及二者交互效应均很显著, 在分别对6-BA和NAA 进行SSR 检验和Duncan 新复很差比较后发现, 当6-BA 浓度在1. 0 mg#L-1 , 而NAA 浓度在0. 1~ 0. 2 mg#L-1 时外植的抽芽效果较好,而NAA 浓度在0. 1~ 0. 2 mg#L-1 对外植体的抽芽作用无明显差异, 因此, 启动培养基为: MS+ 6-BA1. 0 mg#L-1+ NAA0. 1 mg#L-1。
表7 6-BA浓度对外植体抽芽率影响的多重比较
6-BA/mg.L-1 抽芽率/%
1.0 53.33aA
2.0 39.07bB
0 2 0.47cC
3.0 16.91cC
表8 NAA浓度对外植体抽芽率影响的多重比较
NAA/mg.L-1 抽芽率/%
0.2 43.37aA
0.1 43.07 aA
0 23.26bB
0.3 20.59bB
3 结论与讨论
外植体的选择是组织培养中一个非常重要的问题。外植体的生理年龄、发育阶段和外植体取材部位不同都可导致外植体生理生化状态差异,从而影响组织培养的效果。研究结果表明, 不同来源的外植体对污染率的影响较大, 以当年实生苗为外植体时其污染率和褐化率低、成活率较高,半木质化茎段和室内水培芽次之, 而木质化茎段由于长期暴露在空气中, 其表面带菌较多, 容易产生污染现象, 而且木质化茎段含有的次生代谢物较多, 褐化也较严重。此外, 不同外植体对随后腋芽生长也有较大的影响。试验结果表明, 半木质化茎段和木质化茎段接种后都容易抽芽, 芽苗生长也较为健壮; 室内水培芽可能由于体内积累的营养物质含量有限而抽芽时间相对缓慢; 当年实生苗抽芽速度较慢, 且芽苗生长细弱。综合试验结果是选择半木质化茎段作为美国红枫组织培养的外植体。
木本植物组织培养中的困难之一是建立无菌培养体系, 因此为了保证组织培养成功, 在外植体接种前必须进行消毒。试验结果表明, 选用半木质化茎段作为外植体, 经过70% 乙醇和0. 1%升汞的长时间处理后对外植体腋芽的生长产生了较大的影响, 这可能是因为长时间的处理使消毒剂侵入到了材料组织细胞内, 影响了材料的正常生长; 而1% 次氯酸钠消毒后腋芽生长正常, 原因可能是由于次氯酸钠分解性强, 对材料的伤害小。所以研究中外植体在无菌条件下先用70% 的乙醇浸润30 s, 然后用1% 次氯酸钠溶液消毒4 min, 能取得较好的消毒效果。在许多植物组织培养过程中, 减轻和控制外植体褐化问题是一项非常重要的研究内容。组织培养过程中产生褐化的因素多为多酚氧化酶( PPO) 和总酚含量等物质的存在, 在培养基中添加适量的抗氧化剂和吸附剂等可以有效的抑制或减轻褐化现象。在美国红枫培养过程中也普遍存在外植体的褐化现象, 对培养基分别添加Vc、A C、PVP 以及通过不断转换新鲜培养基的处理方法都能不同程度的抑制褐化, 通过比较发现在外植体培养初期每2 d 将外植体转移至新鲜培养基中, 2~ 3 次后即可以较彻底地去除褐化现象, 且对后续的培养没有影响。以美国红枫半木质化茎段为外植体, 在MS+6-BA 1. 0 mg#L-1+ NAA 0. 1 mg#L-1 培养基上进行启动培养, 抽芽率高, 芽苗生长正常。这表明,适当的生长调节剂种类和浓度既可以保证较高的抽芽率, 又可以保证芽苗的生长质量。关于进一步的美国红枫增殖培养和生根培养正在进行研究。