作者：彩枫美国红枫基地 发布时间：2012年8月5日
目前为止，日本红枫主要以成熟胚、顶端分生组织作为日本红枫培养的外植体来源, 但取材受到严格的生长季节限制。而以茎节及叶片作为外植体的愈伤诱导分化成功率比较低，因此本试验以日本红枫品种的嫩茎和新生叶片为外植体材料，在生长素IAA与细胞分裂素6-BA不同浓度组合和MS与WPM不同基础培养基条件下，对其进行外植体愈伤组织诱导增殖和分化的研究。
外植体：采集日本红枫新生枝条上叶片及嫩茎（含茎节）。
1、 外植体的获得
选取带侧枝的幼嫩茎段，切取接近茎节的嫩茎及靠近叶柄部位的叶片，洗涤液浸洗20min，流水冲洗1 ～ 2h，70％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中灭菌4min，无菌水冲洗5次，获得无菌材料待用。
2、愈伤组织诱导培养
嫩茎切成5mm茎段，叶片切成5mm×5mm大小叶块，无菌操作台上接种于MS培养基，激素水平选择为6-BA（0.2、0.4、0.8mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L），25℃下暗处理2d后，1 500±50μmol（photon）/m2•s光强下培养10d（12h/d），观察记录愈伤组织诱导情况。
3、 愈伤组织增殖培养
确定合适的外植体及愈伤组织诱导培养基后，将愈伤组织转入继代增殖培养基，继代培养以MS与WPM为基础培养基，在愈伤组织诱导的基础上，添加的激素水平为6-BA（0.6、0.8mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L），20d后观察记录愈伤组织的增殖情况。
4、 愈伤组织分化培养
将增殖获得的愈伤组织切成1cm3大小的组织块，分别接种于分化培养基中诱导芽的分化。分化培养以1/2MS和WPM为基本培养基，分别添加激素6-BA（0.8、1.4、2.0mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L）。正交试验设计8个处理组合，每个处理组合接种20块，观察并记录芽的分化以及生长状况，选择适宜的分化培养基。
1、 愈伤组织诱导率分析 嫩茎段在接种5d内，所有培养基组合中均不同程度地在茎段切口处开始膨大，并发生黄绿色愈伤组织，其中IAA（0.2mg/L）+6-BA（0.8mg/L）组合诱导率较高，而叶片均未发现变化，出现个别皱缩枯死，可能是部分消毒时脱水严重导致。由表1可知，接种10d后，在叶片周缘也开始出现黄白色愈伤组织，数量明显低于茎段，表明叶片难于诱导愈伤组织，或诱导效率没有嫩茎高。
2、 愈伤组织诱导染菌率分析
由于实验接种数量的有限，所以就外植体对染菌率的影响没有很强的代表性，记录对比得出嫩茎和叶片在诱导愈伤组织中的差异，叶片诱导愈伤组织的染菌率高于嫩茎段，较可能的原因是叶片表面积大，不容易对叶片彻底消毒，其次鉴于采集月份已过初生叶片时期，带菌率会增高。一定程度上能说明采用嫩茎作为外植体诱导愈伤组织更有效。
将初代诱导出的愈伤组织接种于不同继代增殖培养基上，培养14d后观察增殖生长情况，结果见表2。培养基中6-BA/IAA比例较高时（1、2、5、6号），愈伤组织表面有颗粒状突起，颜色偏深，但形态结构致密，生长缓慢，甚至部分停止生长。当6-BA与IAA浓度相对接近时，愈伤组织增殖生长旺盛，形态结构松散，在WPM培养基上也会发生颗粒突起结构，且增殖率普遍高于使用MS培养基。7号培养基（WPM+IAA0.2mg/L+6-BA0.6mg/L）上愈伤组织相对增殖率较高，效果较好。
经增殖培养获得大量的愈伤组织，分瓶转移至设计好的不同分化培养基，对其进行诱导分化，经过20d培养后观察分析。由表3可知，除1号和7号培养基上愈伤组织出现褐变外，大多数分化培养基上愈伤组织开始变得致密，颜色变深，部分愈伤组织中有红色芽原基出现。但随着6-BA/IAA浓度比例增加，只在3、5、6号培养基中有少数不定芽的分化，其中WPM+IAA0.1+6-BA2.0培养基上的出芽率稍高，长势相对较好。高浓度的6-BA可能利于愈伤组织不定芽分化，而选用的1/2MS与WPM基础培养基也未在分化诱导上表现出明显差异。后随着愈伤组织的体积增加以及培养时间的延长，出现大量老化现象，较终没有出现明显的丛生芽。
外植体的建立是离体快繁的基础，选择合适的外植体对植物组培的离体快繁十分重要，不同种类的外植体对离体培养的反应是不同的，培养效果也不同。本次外植体采集时间为4月中旬，气候湿润转暖，叶片生长中带菌率相对较高，且叶片相对面积大不利于灭菌，因此叶片的染菌率明显高于嫩茎。而日本红枫愈伤组织诱导再生体系的探究中，采用幼嫩茎节和叶片理论上都是合适的外植体材料，但由于叶片愈伤组织诱导启动期较长，而实验中叶片染菌率较高，影响了其后期愈伤组织的诱导可能。实验依据日本红枫为木本植物选用了MS、1/2MS和WPM三种基础培养基。结果得知WPM培养基下红枫愈伤组织增殖良好。但只有配合使用适当的植物激素才能诱导细胞的分化，培养物的形态建成、不定芽再生。采用激素是IAA和6-BA，培养基中加入的少量生长素促进细胞分裂，在一定浓度范围内对愈伤组织的形成有明显的促进作用。加入不同的细胞分裂素以促使愈伤组织分化出不定芽。6-BA作为一种常用的细胞分裂素，它在促进红枫腋芽发育的启动、芽的增殖中有显著作用，由于实验以愈伤组织器官发生方式进行，因此6-BA未得到十分显著的效果，可尝试更高的浓度或探索其他的细胞分裂素，以求通过日本红枫非腋芽外植体启动愈伤组织诱导再生体系的研究。